Věda       Akademon       Vesmír       Osel       AVO       Fyzikální ústav AVČR TOPlist
Laboratorní průvodce - na titulní stranu
Užitečné pomůcky:   Tabulky        Encyklopedie        Nástroje 
Katalog dodavatelů:   Rubriky        Firmy        Zastoupení        Laboratorní přístroje 
Ostatní:       Titulní strana        Zajímavé odkazy        O nás        E-obchody 
Nástěnka : Chlazené laboratorní inkubátory LBT 168, www.volny.cz/ats-cz, Předváděcí přístroje z...
Kalendář : 27.2.18 - 2.3.18: SALIMA TECHNOLOGY, Výstaviště Brno, Mezinárodní veletrh...
Reklama
Jak funguje zlepšování výsledků PCR

Problém: ačkoliv PCR je základem v laboratořích molekulární biologie, její průběh je často daleko od ideálních podmínek, což vede k nevhodným reakčním podmínkám a nepřesnosti výsledků. Článek publikovala IDT (Integrated DNA Technologies).

Datum: 12.11.2015

PCR, optimalizace a přesnost výsledků, IDT


 

Sdílet na Facebooku   Odeslat na Twitter

Řešení: Vědci v IDT systematicky studovali PCR protokoly a testovali všechny proměnné. Zde je krátký přehled jejich výsledků:

- Voda - tekuté reakční prostředí. Musí být zbaveno všech kontaminací. Doporučujeme HPLC-grade vodu z láhví.
- PCR buffer - zajišťuje optimální pH a monovalentní soli. Jelikož se požadované koncentrace MgCl2 mohou lišit, zvažte použití bufferu bez MgCl2 a poskyněte jej separátně.
- MgCl2 - přispívá v Mg++ divalentním kationtům. Spoufaktor pro omezení endokukleáz a polymeráz. Koncentrace se musí optimalizovat.
- dNTPs - poskytuje individuální DNA báze pro polymerázy. ß a ? fosfáty dNTPs jsou jedinými zdroji energie pro reakce. Doporučujeme jejich použití v minimálních potřebných dávkách.
- Primery - výchozí body pro funkci polymeráz. Potřebují správný design. Nástroje jako PrimerQuest od IDT to zjednodušují.
- Template DNA - cíl pro amplifikaci. Kvalita a kvantita jsou důležité. Template by měl být tak čistý, jak je jenom možné.
- Polymeráza - katalytický enzym. Zvažujte pečlivě výkonnost, přesnost a stabilitu toho, který používáte.

IDT testovalo širokou škálu reakčních parametů a výsledky můžete najít na: www.idtdna.com (Support & Education > Technical Reports > Breaking PCR).
Reklama

Zde je krátká ukázka detailních výsledků (nepřeloženo):

  • MgCl2 concentration. Varying MgCl2 concentration revealed that for short amplicon primers (SAP: 225 bp product), lower concentrations of MgCl2 (?1 mM) were optimal; high concentrations (3 mM) resulted in non-specific priming. For long amplicon primers (LAP: 1729 bp product), low concentrations of MgCl2 (?1 mM) gave no results whereas higher concentrations (1.5-3 mM) produced excellent results.

  • Template DNA amount. One obvious assumption is that more template DNA = more amplicon. However we found this wasn not always true. We tested inputs of 0 ng, 0.1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng and 1 µg/rxn. While product increased with template inputs up to 100 ng/rxn, diminishing returns were seen with >10 ng/rxn. This is consistent with the plateau phenomenon, where amplification efficiency decreases due to amplicon quenching of polymerase.1

  • Annealing temperature. We found that setting annealing temperature (TA) too low resulted in secondary bands due to sequence mismatch tolerance. For LAP, TA was normally the most effective, while for SAP TA + 5°C gave optimal results.

  • Polymerase extension time. The most surprising result came from decreasing extension times. Reducing it to as little as a quarter of normal had very little effect, implying that DNA polymerase begins to extend immediately upon binding the primer:template duplex. The 72°C extension step is meant to ensure complete extension. However, the enzyme is not inert at TA, and works quite efficiently in vitro.

  • Primer design. Proper primer design is critical to PCR success and online tools, such as IDT PrimerQuest, can greatly facilitate this. Equally important is primer quality.

  • Experiments conducted by IDT show that, while PCR is a robust method, systematic optimization of reaction parameters, correct primer design, and quality template and primers, are vital for the perfect PCR.

  • For more information, see IDT special PCR volume of their DECODED newsletter (Support & Education > DECODED > DECODED 4.2 qPCR).




Zdrojem informací je Labmanager.com.

Pro kompletní informace si přečtěte  celý článek.

 

Hledání:
 
(fulltextové vyhledávání na stránkách tohoto serveru)

Reklama

Reklama